Pokračování článku o exon skipping

Kdy bude terapie na principu exon skipping dostupná?
Dystrofinový gen byl nalezen před dvaceti lety. Všichni byli nadšeni, že příští rok bychom mohli mít lék. Co můžeme říct rodičům, kteří vidí, jak rychle běží čas jejich chlapců? Před dvěma lety mi Gertjan van Ommen z Leidenské university v interview řekl, že to bude trvat tak deset let, než exon skipping bude použitelné u chlapců. Dva roky uběhly, takže zbývá ještě osm. Ptal jsem se rodičů, jestli opravdu chtějí vědět, kdy bude metoda exon skipping použitelná. Jejich odpověď byla: „Ano, chceme to vědět a chápeme, že takovéto odhady nemohou být přesné, že to neznamená, že přesně v lednu 2014 bude něco, co pomůže našemu synovi.“ Jaká je teď situace? Jak dlouho si myslíte, že to bude trvat?
Ano, toto je hodně těžké. Na mítinku Parent Projectu jsem již po šesté. Bohužel, každý rok zde potkám nové lidi a každý rok někteří chybí a už nikdy nepřijdou. Ale my musíme pokračovat pomalu, opatrně, krok za krokem tak, abychom se vyhnuli chybám, které by čekání ještě prodloužily.
Jsem optimistický v jedné věci – pokud budou první klinické testy provedeny pečlivě a bezpečně, potom budou velmi rychle následovat další. Nové testy budou zahrnovat nové cíle, které umožní přeskočení dalších exonů a léčení dalších mutací. Odpadne dlouholeté čekání na výsledky a jejich analýzu. Jakmile dostaneme pozitivní výsledky v jednom pokuse, ihned začneme další.
Jedna z cest, jak urychlit vývoj, je místo vystříhávání jednotlivých exonů, zkusit dva nebo dokonce víc naráz, udělat multi-exon skipping. Proč neudělat koktejl z olig pro vystřižení několika exonů naráz. Už jsme udělali pokus na kultuře svalových buněk se směsí olig pro odstranění exonů 50, 51, 52 a 53 najednou, a funguje to dobře. Jiný koktejl, který jsme zhotovili, je zaměřen na exony 6, 7, 8, což jsou exony, které je potřeba odstranit u dystrofických psů. Takže to můžeme odzkoušet na psech před tím, než to vyzkoušíme na lidech. Tyto koktejly mohou léčit několik různých typů mutací. Další výhodou použití koktejlů je, že je možno dělat bezpečnostní testy tří nebo i více olig naráz. Toto by mělo výrazně urychlit výzkum. Takže, jak to teď vypadá, Gertjanův odhad je docela realistický. Možná ten čas bude i kratší, do pěti až šesti let bychom mohli léčit první chlapce s dobrými výsledky.
Když hovořím s rodiči, často slyším: „Proč DMD potkalo zrovna nás? Co je příčinou?" Odpovídám: „Příčinou jsou mutace. Ty se obje¬vují náhodně, nelze je předvídat." Mutace jsou pouze nástroje evoluce. Kdyby nebyly mutace, nebyli bychom zde ani my, nebyl by život na Zemi, možná jen nějaký sliz. Ale díky evoluci jsou tu i vědci jako vy, kteří se tyto chyby evoluce snaží napravit, opravit vadný gen, vyřešit problém nalezením terapie.
To je zajímavý pohled na věc. Je pravda, že bez evoluce bychom nevznikli. Každý z nás je jiný, každý z nás má pravděpodobně trochu jiný dystrofinový gen. V některých případech dochází ke změně jednotlivých bází a vzniku jiné aminokyseliny, ale pokud to není zrovna velmi důležitá aminokyselina, nejsou tyto změny důležité. Každý dystrofinový gen je trochu jiný, genetická odlišnost je i u jiných genů a také u genů kontrolujících tvorbu bílkovin z jiných genů. Jsme prostě velmi složitá genetická zařízení, což je i důvod, proč různí pacienti s DMD mají různé symptomy.

Výroba oligonukleotidů

Kdo vlastně vyrábí oligonukleotidy? Pravděpodobně se vyrábí automatizovaně, ne?
První 20-metyl oligo jsem si udělal sám za pomoci zařízení, které máme v laboratoři. Zadal jsem AONovou sekvenci, naplnil jej potřebnými chemikáliemi a strávil mnoho bezesných nocí sledováním syntézy AONů. Použité chemikálie jsou velmi drahé a já nenávidím zbytečné plýtvání, takže syntetizér udržujeme nepřetržitě v chodu, jakmile je naplněn chemikáliemi. Dnes už existuje spousta firem, které umí oliga vyrobit, ale já preferuji kontrolu nad celým procesem. Také se tím dozvím víc o používaných chemikáliích. Jakmile jsme optimalizovali naše 2O-metyl oliga na buněčných kulturách, kontaktovali jsme firmu AVI BioPharma v Oregonu, která pro nás teď dělá morfolina. Úzce s námi spolupracují, velmi nás podpořili a dobře se nám s nimi pracuje. A co je nejdůležitější, jsou schopni vyrobit morfolina v kvalitě potřebné pro klinické zkoušky.

Jak budou oliga drahá, až budou použitelná pro chlapce?

Budou drahá, ale ne tak jako produkce virů pro genovou náhradu. Exon skipping bude mnohonásobně levnější. Výrobní cena bude značná, a to ještě budeme potřebovat spoustu morfolin s různými sekvencemi. Pokud ale budeme schopni vytvořit oliga velmi účinná i v malém množství, která můžete podávat v malých dávkách, a budou mít dostatečný terapeutický účinek, tak pak lék nemusí být tak moc drahý.

Včasná diagnóza bude důležitá.

Jestliže exon skipping nebo nějaká jiná technika bude fungovat, neměla by být použita dříve, než svaly zmizí? Stále mám funkční laboratoř pro screening. Přál bych si nalézt investora, který by mohl počkat 5 let, než bude chtít své peníze zpět, a většinu jich utratit na podporu zjišťování svalové dystrofie u novorozenců. Ve Spojených státech právě probíhá pilotní program v Atlantě v Columbusu ve státě Ohio.
Včasná diagnóza bude důležitá. Pokud se prokáže, že metoda exon skipping bude fungovat a bude bezpečná, po včasné diagnóze pak snad bude možné začít léčbu dřív, než se objeví první pří¬znaky. Takže si myslím, že novorozenecká kon¬trola na svalové dystrofie je dobrá idea a měla by být prováděna všude.

Takže je naděje?

Na závěr interview mohl byste říct rodičům něco povzbudivého po mítinku v Cincinnati?
Nejdříve mi dovolte jedno překvapení: Pokrok s morfoliny za poslední rok byl ohromující, získali jsme lepší výsledky, než jsme očekávali. Jsme optimisté a očekáváme, že budou fungovat daleko, daleko lépe, než jsme ještě nedávno předpokládali. Na začátku naší práce jsme zjistili, že morfolino nefunguje dobře na buněčných kulturách. A když jsme začali pracovat na myších s in-vivo injekcemi, dělali jsme spoustu šílených triků, abychom dostali morfolina do svalů. V principu to fungovalo, pak jsme ale zkusili jistý druh negativní kontroly, morfolino pouze v solném roztoku, jen 0.9% běžný solný roztok, a ono to fungovalo bezvadně bez jakéhokoliv nosiče na zlepšení dopravy morfolin do svalů. Jen čisté morfolino v solném roztoku, ten nejjednodušší způsob, jak morfolino podávat, fungoval velmi, velmi efektivně. A pak lidé z AVI Biopharma připojili kousek nějakého peptidu pro ještě lepší účinnost, a ono to fungovalo na myších ještě lépe. Nyní to musíme odzkoušet na lidech. Lidé z AVI, kteří dělají morfolina, jsou velmi akční a novátorští. Vyvíjí nové chemikálie, nové modifikace a je báječné s nimi spolu¬pracovat. Takže morfolina jsou to nejlepší v tento okamžik. I já doufám, že tito lidé přijdou v budoucnu s něčím ještě lepším.
Ale abychom to ukončili. Chci říci, že tento mítink Parent Projectu byl velmi pozitivní.

Zdroj:Ozvena č.1/2008
Z německého jazyka přeložil:Miroslav Stuchlík
Upravila: Dona Zalmanová