Duchenneova muskulární dystrofie (DMD) Exon skipping změní Duchenneovu muskulární dystrofii na daleko mírnější.

Rozhovor s profesorem Wiltonem (I. část)

Profesor Wilton je šéfem skupiny Expe¬rimentální molekulární medicíny v Centru pro nervosvalové a neurologické nemoci na University of Western Australia ve městě Nedlands nedaleko Perthu. 16. 7. 2006 po výroční konferenci PPMD v Cincinnati/Ohio, která proběhla ve dnech 13. – 16. července 2006, profesor Wilton odpovídal na otázky Guentera Schuerbrandta, PhD (otázky psány italikou) o metodě exon skipping, nejpokročilejší metodě léčby Duchenneovy svalové dystrofie.

Exon skipping – klinické pokusy začínají

Exon skipping je technika, která vyvolává syntézu bílkoviny ignorováním části genetic-kého kódu dystrofinového genu, takže dochází k produkci dystrofinu kratšího, než je normální, čímž mění rychle postupující Duchenneovu svalovou dystrofii v daleko pomaleji postupující Beckerovu. Tímto potenciálním lékem jsou antisense oligonukleotidy, zkráceně AONy nebo taky oliga. Během důležitého setkání v Cincinnati byly diskutovány detaily této techniky, které nebudeme v tomto interwiev opakovat.
Na začátek můžete, prosím, vysvětlit rodinám s chlapci s DMD, co velmi slibné výsledky vý¬zkumu znamenají pro ty, kteří zoufale čekají na léčbu této hrozné choroby?

Nepoužíval bych slova léčba. Exon skipping nikdy DMD nevyléčí. V nejlepším případě bu-deme schopni zredukovat závažnost choroby, v některých případech výrazně.
Raději bych byl opatrně optimistický a řekl, že pokud budeme schopni nemoc ovlivnit pomocí metody exon skipping, bude to středně silně.

Hovořím o metodě exon skipping s rodiči docela často. Také jim to vysvětluji a vždy dodávám, že AONy byly odzkoušeny pouze na zvířatech, takže nikdo teď nemůže říct, jestli to bude fungovat i u chlapců. Pak dodávám, že klinické testy na chlapcích s DMD právě teď probíhají, ty nám ukáží, jestli metoda exon skipping bude fungovat na dětech nebo ne.

Právě to je důvod, proč jsem na tomto setká¬ní vždy říkal, že naše laboratoř je schopna vyvolat přeskočení všech exonů kromě exonu 1 a 79. Všechny exony od 2 do 78 dokážeme přeskočit. Mnoho exonů dokážeme snadno odstranit, některé vzdorují, ale vyvíjíme me¬todu zvládající i tyto obtížné exony.
Naše klinické pokusy musí být prováděny pomalu, krok za krokem, na neštěstí pro rodiče, kteří potřebují léčbu nyní. Důležité je, že jakmile zvládneme jeden krok, pokraču¬jeme ihned dalším. V současných klinických testech nepředpokládáme velké bezpečnostní problémy v nynějších klinic¬kých testech, protože je léčen pouze jeden sval a poté odebrán vzorek pro analýzu. Větší rizi¬ko bude, až testy pokročí do fáze systematické léčby celého těla pomocí daleko větších dávek AONů. Zde nelze vyloučit nepředvídatelné vedlejší efekty.
Nikdo neví, jak dlouho dystrofin vydrží po dvou nebo čtyřech týdnech první léčby. V ná-vrhu britského pokusu bude od prvního do čtvrtého týdne každý týden odebrán vzorek z příslušného svalu a otestován molekulární¬mi metodami na přítomnost dystrofinu. To bude důkaz toho, že exon skipping funguje u lidí.
Myslím, že teď nikdo nebude experimen¬tovat s dávkováním nebo dobou podávání. Opravdovým důkazem bude systematická léč¬ba celého těla, která ukáže, jestli exon skipping opravdu funguje i ve všech lidských svalech.
A to bude velmi obtížné, protože netušíme kolik AONů bude potřeba a jak často je bude potřeba podávat.
Francesco Muntoni, který povede britské testy, jednou řekl: „Pronásleduje mne noční můra: jak stanovíme správné dávkování.
Za deset let budeme diskutovat stále ty samé problémy, které se teď řeší u léčby steroidy: podávat obden, nebo deset dní ano, deset ne, nebo podle toho, odkud momentálně fouká!"
A to máme jen dva podobné steroidy, a dosud ani nevíme, jak vlastně fungují.
U metody exon skipping budeme mít různé typy AONů pro různé pacienty s různými mutacemi. Bude to velmi náročný výzkum. Ale možná jsem zde příliš pesimistický.
Holandští vědci z Leidenu právě zkouší vynechání exonů 51 a 46. Zkoušky budou rozšiřovat na další exony. Budou muset pokaždé procházet dlouhavou schvalovací procedurou?
Budou muset mít pokaždé nové schválení, protože technicky každý AON je nový lék. Ale doufáme v to, že AONy pro první pokusy jsou vhodně vybrané vzorky a že u dalších bude možno zkrátit schvalovací proceduru, samozřejmě pokud se všechny budou chovat podobně a nebudou mít nějaké vedlejší nega¬tivní účinky.
My pracujeme na modifikovaných AONech s trochu jiným chemickým složením, které se nazývá morfolino. Tento typ sloučeniny byl již testován na lidech jako potenciální antibiotikum. Morfolína prokázala, že jsou bezpečná, a protože nejsou v těle odbourávána, zdají se být perfektně stabilní. S morfoliny byly provedeny již rozsáhlé testy, a proto nebudou vyžadovat tak rozsáhlé klinické testování jako jiné typy AONů. Například Holanďané používají oligo stabilizované pomocí 20-methyl-thioate, které ještě na lidech nebylo odzkoušeno.
Morfolino má úplně odlišnou, nepřirozenou konstrukci, takže nehrozí, že bude zabudo-váno do genomu. To co děláme, není ani tak genová terapie jako spíš modifikace genového produktu.
Jestliže se ukáže, že prvních pár morfolin jsou bezpečné léky na svalovou dystrofii, doufám, že lidé, kteří mají na starosti lékovou regulaci, vezmou do úvahy předchozí zkušenosti a trochu zjednoduší směrnice, co a jak má být uděláno pro ověření nových olig. Kdybychom museli dělat rozsáhlé testy pro všechna oliga, tak bychom to rovnou teď mohli zastavit. Bylo by prakticky nemožné to provést a nebyli bychom schopni léčit mnoho různých mutací způsobujících Duchenneovu svalovou dystrofii.
V současnosti firma AVI Biopharma z Portlandu v Oregonu vyvíjí morfolinová oliga jako látky účinné proti virům, které by byly určeny pro stovky tisíc lidí. A protože jde o léky určené pro běžnou populaci, musí mít rozsáhlé bezpečnostní testy tak, aby bylo jisté, že ani 0.1% z nich nebude mít neočekávané nebo nepředvídatelné negativní reakce. Naproti tomu naše Duchenneovská oliga nebudou podávána tisícům lidí ale spíš velmi specifickým případům DMD. Takže pokud se vyskytne problémový případ, k čemuž dou¬fáme, že nedojde, mohlo by to postihnout jen jednoho nebo dva chlapce, a protože pacienti budou velmi pečlivě sledováni během léčby, všechny negativní reakce by měly být zjištěny velmi rychle a měly by být okamžitě učiněny potřebné kroky.
Stále se mohou vyskytnout různé účinky pro různé nukleotidové sekvence olig. Musíme si být vědomi tohoto rizika. Toto je otázka zváže¬ní potenciálních vedlejších negativních účinků a možného zisku. Dokonce, i kdyby se vyskytly nějaké vedlejší účinky u morfolin zaměřených na některé mutace, zisk z obnovení tvorby určitého množství dystrofinu by mohl převážit toto riziko. Steroidy mají mnoho vedlejších účinků, a přesto jsou akceptovány jako nejlepší léčba.
Na tomto setkání Dominic Wells ukázal, že když injikoval AONy přímo do svalů myší, dosáhl velmi dobrých výsledků ve vynechávání potřebných exonů na RNA úrovni ještě po 14 dnech. To znamená, že morfolina vyvolávají přeskočení exonů ještě nejméně po 14 dnech. A samotná bílkovina bude daleko stabilnější než RNA. To znamená, že po 14 dnech byste mohli dostat spoustu dystrofinu, který by mohl vydržet až 26 týdnů, to je 6 měsíců! Nikdy jsem nepředpokládal, že by účinky mohly být tak dlouhodobé. Funguje to lépe, než se oče¬kávalo. A jestliže se vyskytnou vedlejší účinky poté, co chlapec dostane morfolino, doufáme, že se najdou cesty, jak to dostat pod kontrolu. V takovém případě bude mít chlapec asi nepří¬jemný jeden týden a pak bude do další léčby, tj. 6 měsíců, v pohodě. A zase musíme zjistit, jestli léčba dvakrát ročně bude postačující. Můžeme to přirovnat k chemoterapii nebo radioterapii při léčbě rakoviny. I ty mají závažné vedlejší efekty. A přesto jsou akceptovány, protože nic jiného prostě není.

Dva typy antisense oligonukleotidů

Holanďané zkouší svou verzi oliga (20-me-thylphosphoti­oathes) pro přeskočení exonu 51. Vy a Britové budete testovat morfolino.
Budete spolupracovat? A jaký je důvod toho, že Holanďané pracují s jejich odlišným typem oligonukleotidů?
Holanďané se zaměřili na řadu různých exonů, Angličané provedli porovnání různých AONů a zjistili, že sloučeniny, které jsme vyvi¬nuli, fungují velmi dobře, obzvláště morfolino, a proto se rozhodli jej použít v jejich klinických testech, které jsou stále ve fázi plánování. Zkusí také přeskočení exonu 51, a to z důvodu mít paralelní studii k Holandským testům. Takže budou moci porovnat AONy s různým chemickým složením a porovnat účinnost různých typů léčby. To by nemohlo být provedeno, kdyby zkoušeli vynechání jiného exonu. Takže pokud oba typy AONů budou bezpečné, práce na obou budou pokračovat. Doufejme, že oba budou mít podobné výsledky.
Nikdo fakticky neví, co se může stát při dlouhodobém vystavení organismu různým AONům. Vycházíme z toho, že konkurence je zdravá a že nejsou „všechna vejce v jednom koši". Jestliže obě metody jsou nadějné, musíme pokračovat v obou.
A opět, pokud se něco stane po třech letech léčby morfolinem, vrátíme se zpět k 20-methylu. Pokud ale nebudeme mít nic než jen mor¬folino, tak budeme mít problém. Proto kromě morfolina a 20-methylu pracujeme i s dalšími typy AONů s jiným chemickým složením.

První experimenty s exon skipping

Čí je metoda exon skipping nápad?
Myslím, že to bylo vyvinuto současně na několika různých místech. Pracoval jsem na revertantních vláknech s dystrofinem, která se spontánně vyskytují v dystrofických svalech u některých chlapců s DMD, a zkoušel jsem zjistit, jaký mechanismus to způsobuje. A bylo mi jasné, že je to mechanismus umožňující přeskočit vhodný exon. Bylo to přibližně v roce 1994, kdy jsme objevili funkční mRNA pro zkrácený dystrofin. Později, v roce 1996 jsem na mítinku v Lake Tahoe potkal Ryszarda Kole z University Severní Karolíny. Hovořil tam o potlačení abnormálního sestřihu v globinovém genu jako terapii pro thalassemii. Pokud vím, byl prvním člověkem, který modifikoval expresi genu modifikací sestřihu. Později jsem s Ryszardem několikrát hovořil a při jednom takovém rozhovoru mi to došlo, bylo to jako z čistého nebe. Bylo jasné, že to právě takhle funguje. Jestliže je možno použít AONy pro potlačení abnormálního sestřihu, proč nezkusit stejný postup pro normální sestřih? Pár týdnů po návratu do Perthu jsem obdržel nějaká oliga od Ryszarda. Měli jsme jen pár nepříliš dobrých kultur svalových vláken, přesto jsme udělali pár pokusů a pomocí jednoho z Ryszardových olig dosáhli prvního přeskočení exonu.

Takže jste byl první, kdo aplikoval tuto techniku u svalové dystrofie?
Svým způsobem ano. Přinejmenším to byl první pokus odstranit mutaci na dystrofinové mRNA způsobující chorobu. Myslím ale, že Matsuo z Kobe v Japonsku byl první, kdo aplikoval AONy na transkript dystrofinového genu. Udělal to dříve, ale tehdy jsem to nevěděl. On ale fakticky vyvolával „Kobe“ mutaci, deleci exonu 19 na normálním dystrofinovém transkriptu. Byl pravděpodobně prvním člověkem, který provedl přeskočení exonu na dystrofinovém genu.
Nedávno léčil chlapce s DMD s delecí exonu 20 nitrožilní injekcí speciálního DNA oliga zaměřeného na exon 19. Podle posledních informací u tohoto chlapce bylo nalezeno 6% normálního množství dystrofinové mRNA a také nějaký dystrofin. Podle dat, která jsem viděl, to ale nebylo přesvědčivé. Aspoň však dokázal, že systematický exon skipping je u chlapců s DMD možný bez nebezpečných vedlejších účinků.
Myslím, že hlavní problém zde byl výběr DNA oliga, 3 které, pokud tomu správně rozu-mím, reaguje s RNA tak, že mRNA je zničena enzymem nazývaným RNAseH. Byl to závod mezi exon skipping mechanismem a mRMA degradací pomocí RNAseH. Zopakovali jsme Matsuův pokus na myších a zjistili, že funguje jen pro některé cíle (myšleny další exony, resp. jejich okraje, které se účastní mechanismu „slepování“ exonů), nikoliv pro všechny. Pak jsme zkusili obyčejné 20-methyl oligo se stejnou sekvencí pro stejný exon 19, to bylo 30× až 40× efektivnější. Je to způsobeno tím, že 20-methyl oligo je stabilní oligo, které pronikne do buněk a vyvolá přeskočení exonu, ale nespouští RNAseH mechanismus.

(pokračování v příštím čísle)
Zdroj: Ozvena č.1/2008
z německého jazyka přeložil: Miroslav Stuchlík
upravila: Dona Zalmanová